Sirt1通过血红素氧化酶-1调控脓毒症内皮细胞自噬对凋亡的影响

【摘要】第一部分脂多糖干预对血管内皮细胞凋亡和自噬的影响目的：1、选择合适的脂多糖浓度和干预时间复制脓毒症内皮细胞模型。2、明确脂多糖干预对内皮细胞凋亡和自噬的影响。3、明确自噬对脓毒症内皮细胞凋亡的影响。方法：第一步：体外培养脐静脉内皮细胞(HUVEC),给予不同浓度(0μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、50μg/ml)和不同时间(Oh、12h、24h、48h)脂多糖干预。用MTT法测定各组HUVEC相对存活率。用ELISA法测定各组IUVEC培养液上清中TNF-α、IL-6、血管内皮生长因子、脂联素表达水平。用流式细胞仪检测各组HUVEC凋亡率。用免疫荧光法检测各组HUVEC自噬强度。根据细胞存活率、炎症因子表达、凋亡率选择合适的脂多糖浓度和干预时间复制脓毒症细胞模型。第二步：在合适浓度和时间LPS干预HUVEC复制脓毒症内皮细胞模型基础上,将HUVEC分为3组,分别为：对照组(0μg/mlLPS组)、LPS组和3-MA+LPS组(3-MA为自噬抑制剂)。用MTT法测定LPS干预后各组HUVEC相对存活率。用小管形成实验检测各组HUVEC小管合围长度和面积。用流式细胞仪检测各组HUVEC凋亡率。用免疫荧光法检测各组HUVEC自噬强度。用定量RT-PCR测定凋亡相关基因(caspase-3)和自噬相关基因(beclin-1.LC3B)mRNA相对表达量。用western-blot检测凋亡相关蛋白(Caspase-3)和自噬相关蛋白(Beclin-1.LC3B)相对表达量。各组计量资料以(Mean±SD)表示,采用SPSS18.0软件进行One-WayANOVA检验比较呈正态分布的多个独立样本均数,用Kruskal-WallisH进行非正态分布的多个独立样本均数比较检验,用LSD-t检验进行正态分布的多样本间均数的多重比较。P<0.05认为组间差异有统计学意义。结果：1、LPS干预HUVEC后存活率呈浓度和时间依赖模式下降.设对照组(Oμg/mlLPS干预)HUVEC存活率为1,LPS(5μg/ml)组:0.93±0.03,LPS(10μg/ml)组:0.84±0.03,LPS(50pg/ml)组：0.65±0.02。各不同浓度LPS干预组两两比较差异有统计学意义；比较10μg/mlLPS干预培养HUVEC细胞不同时间点存活率,设Oh组存活率为1,12h组：0.88±0.02,24h组：0.81±0.04,48h组：0.69±0.02。各时间点LPS干预组两两比较差异有统计学意义。2、LPS不同浓度和不同时间点干预HUVEC细胞培养液上清TNF-α、IL－6和血管内皮生长因子浓度与对照组(分别为0μg、mlLPS组和0h组)比较上升；LPS干预组HUVEC细胞培养液上清脂联素浓度与对照组(分别为Opg/mlLPS组和Oh组)比较下降。3、LPS干预HUVEC细胞凋亡率(%)呈浓度和时间依赖模式增加。各浓度LPS组凋亡率分别为：对照组：3.68±0.14,LPS(5μg/ml)组：5.93±0.18,LPS(10μg/ml)组：11.57±0.23,LPS(50μg/ml)组：15.15±0.46。各浓度组间两两比较差异有统计学意义；以10μg/mlLPS干预培养HUVEC细胞,各时间点凋亡率分别为：Oh组：2.58±0.12,12h组：9.12±0.55,24h组：11.70±0.83,48h组：14.69±0.65。各时间点组间两两比较差异有统计学意义。4、LPS干预HUVEC细胞自噬强度随浓度递增呈低、中浓度上升、高浓度下降模式变化。各LPS浓度组自噬强度分别为：对照组：60.78±2.00,LPS(5μg/m1)组:85.70±6.56,LPS(10μg/ml)组：133.96±4.8,LPS(50μg/ml)组：115.19±8.46。各浓度组间两两比较差异有统计学意义；LPS干预HUVEC细胞自噬强度随时间递增呈先上升后下降趋势。各时间点组自噬强度分别为：Oh组：60.78±2.00,12h组：111.71±6.48,24h组：133.96±4.81,48h组：96.49±6.74。各时间点组间两两比较差异有统计学意义。5、在合适浓度和时间LPS干预HUVEC复制脓毒症内皮细胞模型基础上。以自噬抑制剂3-MA干预LPS刺激的HUVEC,观察自噬抑制剂对脓毒症内皮细胞存活率、小管形成能力、凋亡率和自噬强度的影响。细胞存活率：设对照组存活率为1,LPS组：0.84±0.03,3-MA+LPS组：0.68±0.03。三组间两两比较差异有统计学意义；各组内皮小管合围长度(μm)分别为：对照组：47.06±2.66,LPS组：22.03±2.55,3-MA+LPS组；13.57±1.84。三组间两两比较差异有统计学意义；各组内皮小管合围面积(μm2)分别为：对照组：113.03±5.47,LPS组:44.87±3.81,3-MA+LPS组：25.60±2.83。三组间两两比较差异有统计学意义；各组细胞凋亡率(%)分别为：对照组：3.68±0.14,LPS组：11.57±0.23,3-MA+LPS组：14.19±0.60。三组间两两比较差异有统计学意义；各组自噬强度分别为：对照组；60.78±2.00,LPS组:133.96±4.81,3-MA+LPS组：80.43±4.39。三组间两两比较差异有统计学意义；各组凋亡相关基因caspase-3mRNA相对表达量分别为：对照组：1.52±0.10,LPS组:6.05±0.92,3-MA+LPS组：8.01±1.17,三组间两两比较差异有统计学意义；各组Caspase-3蛋白相对表达量分别为：对照组：0.29±0.05,LPS组:0.90±0.02,3-MA+LPS组：1.10±0.02,三组间两两比较差异有统计学意义；各组beclin-1mRNA相对表达量分别为：对照组：1.38±1.02,LPS组:9.00±1.54,3-MA+LPS组：6.05±0.44,三组间两两比较差异有统计学意义；各组Beclin-1蛋白相对表达量分别为：对照组：0.34±0.80,LPS组：1.38±0.57,3-MA+LPS组：1.05±0.90,三组间两两比较差异有统计学意义；各组LC3BmRNA相对表达量分别为：对照组：2.05±0.24,LPS组:7.00±0.90,3-MA+LPS组：6.06±0.59,三组间两两比较差异有统计学意义；各组LC3B蛋白相对表达量分别为：对照组：0.90±0.07,LPS组:1.91±0.16,3-MA+LPS组：1.58±0.10,三组间两两比较差异有统计学意义。结论：1、10μg/ml脂多糖干预HUVEC24h可以较好的模拟脓毒症内皮细胞炎症反应和细胞凋亡反应。2、脂多糖干预HUVEC后凋亡和自噬增加,自噬发挥细胞适应性保护作用。3、抑制脓毒症内皮细胞自噬导致细胞凋亡增加。第二部分血红素氧化酶-1对脓毒症内皮细胞凋亡和自噬的影响目的：1、明确不同浓度脂多糖干预对HUVECHO-1表达的影响。2、明确HO-1对脓毒症内皮细胞凋亡和自噬的影响。方法：第一步:HUVEC分别与终浓度为0μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、50μg/ml的含LPS的培养液中共孵育24h。以0μg/mlLPS干预HUVEC组为对照组,用定量RT-PCR检测HUVECHO-1mRNA表达,用western-blot检测HO-1蛋白表达。第二步：在合适浓度和时间LPS干预HUVEC复制脓毒症内皮细胞模型基础上,用HO-1激动剂(hemin)、抑制剂(ZnPP)和自噬抑制剂(3-MA)联合HO-1激动剂(hemin)分别预处理LPS干预的]3UVEC24h,以未干预培养的HUVEC为对照组,仅LPS干预的HUVEC为LPS组,HO-1激动剂hemin预处理LPS干预培养的HUVEC为hemin组,HO-1抑制剂ZnPP预处理LPS干预培养的HUVEC为ZnPP组,以3-MA联合hemin预处理LPS干预培养的HUVEC为3-MA+hemin组。用MTT法检测各组细胞存活率；用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率；免疫荧光法检测各组自噬强度；用定量RT-PCR和Western-blot方法分别检测凋亡相关基因(caspase-3)和自噬相关基因(beclin-1和LC3B)mRNA和蛋白表达。各组计量资料以(Mean±SD)表示,采用SPSS18.0软件进行One-WayANOVA检验比较呈正态分布的多个独立样本均数,用Kruskal-WallisH进行非正态分布的多个独立样本均数比较检验,用LSD-t检验进行正态分布的多样本间均数的多重比较。P<0.05认为组间差异有统计学意义。结果：1、定量RT-PCR和western-blot检测不同浓度LPS干预的HUVECHO-1mRNA和蛋白表达。各组HO-1mRNA相对表达量分别为：对照组:1.03±0.03,LPS(5μg/ml)组:1.21±0.07,LPS(10μg/ml)组：2.30±0.13,LPS(50μg/ml)组：2.31±0.12。各组HO-1蛋白相对表达量分别为：对照组:0.27±0.03,LPS(5μg/ml)组:0.46±0.01,LPS(10μg/ml)组：0.66±0.03,LPS(50μg/m1)组：0.68±0.03。比较各组HO-1mRNA和蛋白相对表达量：与对照组比较,LPS(5μg/ml)组、LPS(5μg/ml)组和LPS(50μg/ml)组HO-1mRNA和蛋白相对表达量增加,LPS(50μg/ml)组最高。LPS(10μg/ml)组与LPS(50μg/ml)组比较,HUVEC表达HO-1mRNA和HO-1蛋白相对表达量比较差异无统计学意义。2、MTT法检测各组细胞存活率。设对照组为1,其他各组细胞存活率均值分别为：LPS组:0.84±0.04,hemin组:0.93±0.06,ZnPP组:0.81±0.04,3-MA+hemin组:0.81±0.06。ZnPP组和3-MA+hemin组细胞存活率无显著差异,其他各组间细胞存活率两两比较差异均有统计学意义。3、用流式细胞仪检测各组凋亡率(%),各组细胞总凋亡率分别为：对照组:3.68±0.14,LPS组:13.20±0.54,hemin组:9.20±0.36,ZnPP组:14.70±0.45,3-MA+hemin组：11.20±0.46。各组间细胞凋亡率的两两比较差异均有统计学意义。4、用免疫荧光法检测各组自噬强度,各组自噬强度均值分别为：对照组：76.06±4.14,LPS组:133.96±4.81,hemin组：206.82±2.11,ZnPP组:106.18±7.02,3-MA+hemin组：89.26-3.10。各组间细胞自噬强度两两比较差异均有统计学意义。5、定量RT-PCR和western-blot检测各干预组的HUVECHO-1mRNA和蛋白相对表达量。各组HO-1mRNA相对表达量分别为：对照组：1.03±0.03,LPS组:2.31±0.31,hemin组:4.42±0.36,ZnPP组:1.29±0.11,3-MA+hemin组：4.30±0.20。各组HO-1蛋白相对表达量分别为：对照组：0.41±0.02,LPS组:0.77±0.09,hemin组：1.49士0.07,ZnPP组:0.48±0.05,3-MA+hemin组：1.41±0.05。各组间HO-1mRNA和蛋白相对表达量两两比较差异均有统计学意义。6、定量RT-PCR和western-blot检测各组HUVECcaspase-3mRNA和蛋白表达,各组caspase-3mRNA相对表达量分别为：对照组：1.52±0.09,LPS组:6.05±0.92,hemin组：3.02±0.46,ZnPP组：8.01±1.17,3-MA+hemin组：5.02±0.93。各组Caspase-3蛋白相对表达量分别为：对照组为：0.29±0.05,LPS组:0.87±0.07,hemin组：0.52±0.06,ZnPP组:1.10±0.02,3-MA+hemin组：0.69±0.05。各组间caspase-3mRNA和蛋白相对表达量两两比较差异均有统计学意义。7、定量RT-PCR和western-blot检测各组HUVECbeclin-1mRNA和蛋白表达,各组beclin-1mRNA相对表达量分别为：对照组：1.05±0.03,LPS组:6.05±0.44,hemin组:9.00±1.54,ZnPP组:5.05±0.49,3-MA+hemin组：3.00±0.55。各组Beclin-1蛋白相对表达量分别为：对照组：0.344±0.08,LPS组为:1.05±0.09,hemin组:1.38±0.06,ZnPP组:0.82±0.04,3-MA+hemin组：0.62±0.07。各组间beclin-1mRNA和蛋白相对表达量两两比较差异均有统计学意义。8、定量RT-PCR和western-blot检测各组HUVECLC3BmRNA和蛋白表达,各组LC3BmRNA相对表达量分别为：对照组：2.05±0.24,LPS组L:6.06±0.59,hemin组:7.00±0.90,ZnPP组：4.51±0.61,3-MA+hemin组：3.48±0.39。各组LC3B蛋白相对表达量分别为：对照组：0.85±0.06,LPS组:1.58±0.10,hemin组:1.91±0.16,ZnPP组:1.40±0.06,3-MA+hemin组：1.11±0.06。各组间LC3BmRNA和蛋白相对表达量两两比较差异均有统计学意义。结论1、在一定浓度范围内,LPS干预可以呈剂量依赖模式促进HO-1表达。2、HO-1参与调控脓毒症内皮细胞凋亡和自噬。3、HO-1通过促进脓毒症内皮细胞自噬抑制凋亡。第三部分sirtl对血红素氧化酶-1调控脓毒症内皮细胞凋亡和自噬的影响目的：1、明确脓毒症内皮细胞中sirt1对血红素氧化酶-1的作用。2、明确sirt1对脓毒症内皮细胞凋亡和自噬的影响。方法：第一步：通过生物信息网站查找sirt1基因序列,通过生物信息软件构建sirt1-siRNA套餐。细胞分为对照组(HUVEC正常培养组)、siRNA阴性片段组(siRNA阴性片段转染HUVEC组)和各候选sirt1-siRNA组(候选sirt1-siRNA转染HUVEC组)。用定量RT-PCR和western-blot方法测定对照组、siRNA阴性片段组和各候选sirt1-siRNA组IUVEC中的sirt1-mRNA和蛋白相对表达量,选择合适的sirt1-siRNA片段。比较24h和72hsirt1-siRNA转染率(%),选择合适的转染时间点。第二步：在合适浓度和时间LPS干预HUVEC复制脓毒症内皮细胞模型、选择最佳sirt1-siRNA片段和最佳转染时间基础上,实验分为对照组(无干预HUVEC)、LPS组(脓毒症内皮细胞组)、sirtl-阴性片段组(sirt1阴性片段转染脓毒症内皮细胞组)、sirt1-siRNA组(sirt1-siRNA转染脓毒症内皮细胞组)、白藜芦醇(sirt1激动剂)组(白藜芦醇干预脓毒症内皮细胞组)。用MTT法测定各组细胞存活率；用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率；用免疫荧光法检测自噬强度；用定量RT-PCR和western-blot方法检测各组HO-1、凋亡和自噬相关基因mRNA和蛋白相对表达量。各组计量资料以(Mean±SD)表示,采用SPSS18.0软件进行One-WayANOVA检验比较呈正态分布的多个独立样本均数,用Kruskal-WallisH进行非正态分布的多个独立样本均数比较检验,用LSD-t检验进行正态分布的多样本间均数的多重比较。P<0.05认为组间差异有统计学意义。结果：1、经过生物信息学软件选择含sirt1-siRNA-238、siRNA-1185、siRNA－2010和阴性片段组成的sirt1－siRNA套餐.合成阴性片段和各siRNA片段后转染HUVEC24h,定量检测各组HUVECsirt1-mRNA相对表达量分别为：对照组:9.48±0.92,siRNA阴性片段组：9.52±1.14,siRNA-238组:1.03±0.03,siRNA-1185组:2.30±0.53,siRNA-2010组9.48±1.34。定量检测各组SIRT1蛋白相对表达量分别为：对照组:1.18±0.11,siRNA阴性片段组:1.17±0.11,siRNA-238组：0.34±0.04,siRNA.1185组:0.67±0.06,siRNA-2010组：1.08±0.07。比较各组相对表达量,显示siRNA-238组sirt-1mRNA和蛋白相对表达量最低,与实验中其他各组比较差异有统计学意义。24h、72h点sirt1-siRNA-238转染率(%)分别为84.00±1.15,68.30±2.03。72h组与24h组转染率比较显著降低,差异有统计学意义。2、MTT法检测细胞存活率：设对照组细胞存活率为1,LPS干预组:0.84±0.05,siRNA阴性片段组:0.82±0.03,sirt1-siRNA组：0.76±0.05,白藜芦醇组：0.90±0.03。LPS干预组与siRNA阴性片段组细胞存活率无显著性差异,余各组间两两比较差异均有统计学意义；3、流式细胞仪检测各组凋亡率(%)分别为：对照组：3.62±0.08,LPS干预组:12.5±0.33,siRNA阴性片段组:12.68±1.07,sirt1-siRNA组：17.10±0.12,白藜芦醇组：7.12±0.19。LPS干预组与siRNA阴性片段组细胞凋亡率无显著性差异,余各组间两两比较差异均有统计学意义；4、免疫荧光法检测各组自噬强度分别为：对照组：72.06±3.54,LPS干预组:133.96±4.81,siRNA阴性片段组：130.67±15.86,sirt1-siRNA组：105.88±8.29,白藜芦醇组：185.38±10.76。LPS干预组与siRNA阴性片段组细胞自噬强度无显著性差异,余各组间两两比较差异均有统计学意义；5、定量RT-PCR检测各组HUVECHO-1mRNA相对表达量分别为：对照组：1.07±0.06,LPS组:2.31±0.34,siRNA阴性片段组：2.80±0.27,sirt1-siRNA组：1.49±0.09,白藜芦醇组6.57±0.79。Western-blot法测定HO-1蛋白相对表达量分别为：对照组：0.51±0.08,LPS组:0.95±0.07,siRNA阴性片段组:0.94±0.08,sirt1-siRNA组：0.65±0.06,白藜芦醇组：1.31±0.02。LPS干预组与siRNA阴性片段组HO-mRNA和蛋白的相对表达量均无显著性差异,余各组间HO-mRNA和蛋白的相对表达量的两两比较差异均有统计学意义；6、定量RT-PCH检测各组HUVECcaspase-3mRNA相对表达量分别为：对照组：1.52±0.10,LPS组:5.02±0.93,siRNA阴性片段组：5.18±0.78,sirt1-siRNA组：8.01±1.17,白藜芦醇组:3.02±0.46。Western-blot法测定Caspase-3蛋白相对表达量分别为：对照组：0.29±0.05,LPS组:0.62±0.03,siRNA阴性片段组:0.62±0.06,sirt1-siRNA组：0.85±0.06,白藜芦醇组：0.50±0.03。LPS干预组与siRNA阴性片段组caspase-3mRNA和蛋白相对表达量均无显著性差异。余各组间caspase-3mRNA和蛋白相对表达量两两比较差异均有统计学意义；7、定量RT-PCR检测各组beclin-1mRNA相对表达量分别为：对照组：1.05±0.03,LPS组:5.05±0.49,siRNA阴性片段组:5.52±0.45,sirt1-siRNA组：3.00±0.55,白藜芦醇组9.00±1.54。各组Beclin-1蛋白相对表达量分别为：对照组：0.34±0.08,LPS组:0.98±0.07,siRNA阴性片段组：1.05±0.08,sirt1-siRNA组：0.76±0.06,白藜芦醇组：1.38±0.06。LPS干预组与siRNA阴性片段组beclin-1mRNA和蛋白相对表达量比较均无显著性差异。余各组间beclin-1mRNA和蛋白的相对表达量两两比较差异均有统计学意义；8、各组LC3BmRNA相对表达量分别为：对照组：2.05±0.24,LPS组:4.51±0.61,siRNA阴性片段组:4.47±0.61,sirt1-siRNA组：3.48±0.39,白藜芦醇组：7.00±0.90。各组LC3B蛋白相对表达量分别为：对照组：0.90±0.08,LPS组：1.58±0.10,siRNA阴性片段组：1.55±0.07,sirt1-siRNA组：1.18±0.08,白藜芦醇组：1.91±0.16。LPS干预组与siRNA阴性片段组LC3BmRNA和蛋白相对表达量比较均无显著性差异。余各组间LC3BmRNA和蛋白相对表达量两两比较差异均有统计学意义；结论：1、sirt1在脓毒症内皮细胞中参与调控HO-1表达。2、sirt1参与调控脓毒症内皮细胞凋亡和自噬。
【作者】贺志飚；
【导师】陈平；
【作者基本信息】中南大学，临床医学，2014，博士
【关键词】脂多糖；脓毒症；脐静脉内皮细胞；凋亡；自噬；内皮细胞；血红素氧化酶-1；sir1；siRNA；

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